公司动态
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外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
1. Taq DNA聚合酶
2. 安苄青霉素
3. 葡萄糖
4. X-gal
5. IPTG
6. pMD18-T载体
7. LB培养基
8. 溶液I、溶液II、溶液III
9. 苯酚
10.
11. 95%乙醇
12. 无水乙醇
13. RNAase A
14. DNA Marker
1. 培养皿
2. 涂玻棒
3. 移液枪
4. 枪头
5. 1.5ml离心管
6. PCR 管
7. PCR仪
8. 恒温培养箱
9. 恒温摇床
10. 恒温水浴锅
11. 离心机
12. 无菌操作台
1. 引物设计
从NCBI上下载线虫unc-22基因序列（GenBank登录号：NM_069873），依照此序列用 Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
2. 目的基因片段的PCR扩增
25μl反应体系：
模板cDNA 1.5μl
10×reaction buffer 2.5μl
2.5mM MgCl2 2μl
2.5mM dNTP 2μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl
加ddH2O至总体积 25μl
按照以下程序进行PCR扩增：
94℃预变性4min；
94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5μl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
3. 目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
4. 目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下：
纯化回收的PCR产物 4μl
Ligation SolutionⅠ 5μl
pMD18-T Vector DNA 1μl
混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
5. 连接产物的转化
1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；
2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；
3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
4) 加入880μl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20μl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、 4μl IPTG和56μl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100μg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
6) 取适量的菌液(200μl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
6. 重组质粒的筛选
分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100μg/μl 氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；
2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；
5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和，轻轻摇匀，静置2分钟；
7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；
8) 加入400μl摇匀， 4℃，12000rpm离心5min；
9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；
10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。
7. 重组质粒的测序验证