ELISA试剂盒测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。正确的加样方法应为45度，吸头贴着孔壁加入，应注意角度太小，会使液体残留在孔壁上，导致加样不准确；吸头应当贴着管壁和液面的交界处！
目前上使用血清标本测定的标志物一般有原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，用于ELISA试剂盒测定的临床标本为常用的是血清（浆），有时由于特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要留意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的时间抽血检测。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将泛起显著增高。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值泛起：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式开释，因此，在测定此类激素时，有必要在紧密亲密相连的时间距离内采取数份血样本，以其中间值为测定值。只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面：
首先要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8 ℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70 ℃以下。样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。