在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。

酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。

其步骤为：

先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。

然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４0.05ml终止反应。

结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。